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服务简介: DUALmembrane 技术在传统的酵母双杂交系统的基础上,巧妙地利用分离的泛素系统(split-ubiquitin)进行蛋白质相互作用的筛选。 泛素(ubiquitin)分子量很小,由76aa残基组成; 高度保守的蛋白质;泛素作为降解信号分子,可以连接另外一种蛋白质的N端,然后被泛素专一性蛋白酶(UBPs)识别,从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。 分离的泛素系统(split-ubiquitin):泛素可以人为分成两部分:N端(Nub),C端(Cub)。 正常情况下,Nub和Cub仍具有很高的亲合力,表现出野生型泛素的功能,即仍发挥降解蛋白质的信号功能。 那么如何将泛素系统和酵母双杂交融合成一体呢?首先,人为地将泛素 Nub的3位异亮氨酸突变为甘氨酸(NubI突变为NubG)。这样与Cub的亲合力大大降低,避免了Cub和Nub自我结合或接近的可能性; 其次,将Cub部分与人工合成的LexA-VP16转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。因此正常条件下NubG 不与Cub结合,UBPs也不能识别分离的泛素,转录激活因子也不会被切下来。 最后,将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合,形成Bait融合蛋白(Bait-cub-LexA-VP16)和Prey融合蛋白(Prey-NubG)。如果Bait和Prey发生相互作用,就会促使NubG和Cub的相互接近,从而得到重构,被UBPs识别,导致LexA-VP16的解离,进入核内,从而激活报告基因的转录。 实验流程: 1.诱饵蛋白与猎物蛋白的生物信息学分析; 2.实验方案的制定; 3.诱饵蛋白表达载体构建; 4.诱饵功能检测及诱饵载体挑选; 5.3-AT工作浓度检测; 6.文库转化; 7.阳性克隆转接。 客户提供: 诱饵序列、模板及文库。 交付内容: 1.原始数据、结果图片; 2.阳性克隆子。 上一篇酵母双杂全能型系统文库筛选下一篇酵母双杂核系统文库筛选 |