酵母双杂全能型系统文库筛选

服务简介：

  DUALmembrane 技术在传统的酵母双杂交系统的基础上，巧妙地利用分离的泛素系统（split-ubiquitin）进行蛋白质相互作用的筛选。

  泛素（ubiquitin）分子量很小，由76aa残基组成； 高度保守的蛋白质；泛素作为降解信号分子，可以连接另外一种蛋白质的N端，然后被泛素专一性蛋白酶（UBPs）识别，从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。

  分离的泛素系统（split-ubiquitin）：泛素可以人为分成两部分：N端（Nub），C端（Cub）。 正常情况下，Nub和Cub仍具有很高的亲合力，表现出野生型泛素的功能，即仍发挥降解蛋白质的信号功能。                                    

  那么如何将泛素系统和酵母双杂交融合成一体呢？首先，人为地将泛素 Nub的3位异亮氨酸突变为甘氨酸（NubI突变为NubG）。这样与Cub的亲合力大大降低，避免了Cub和Nub自我结合或接近的可能性； 其次，将Cub部分与人工合成的LexA-VP16转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。因此正常条件下NubG 不与Cub结合，UBPs也不能识别分离的泛素，转录激活因子也不会被切下来。 最后，将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合，形成Bait融合蛋白（Bait-cub-LexA-VP16）和Prey融合蛋白（Prey-NubG）。如果Bait和Prey发生相互作用，就会促使NubG和Cub的相互接近，从而得到重构，被UBPs识别，导致LexA-VP16的解离，进入核内，从而激活报告基因的转录  。

  DUALhunter系统就是在DUALmembrane系统的基础上，做了适当的修改，即通过一个小的膜蛋白（酵母ER蛋白Ost4）将胞浆蛋白（或核蛋白）固定到胞膜上，便于检测。

     首先，将Bait蛋白（Bait-Cub-LexA-VP16）的N端和一个小膜锚蛋白（Ost4）融合在一起，形成融合蛋白（Ost4-Bait-Cub-LexA-VP16）（见图E）；接着，将靶蛋白融合到泛素NubG部分的N端；如果Bait和Prey存在相互作用，促使泛素的NubG和Cub两个部分靠近，，从而分离的泛素得到重构，被UBPs识别，导致LexA-VP16的解离，进入核内，从而激活报告基因的转录。

实验流程：

1.诱饵蛋白与猎物蛋白的生物信息学分析；

2.实验方案的制定；

3.诱饵蛋白表达载体构建；

4.诱饵功能检测；

5.3-AT工作浓度检测；

6.文库转化；

7.阳性克隆转接。

客户提供：

诱饵序列、模板及文库。

交付内容：

1.原始数据、结果图片；

2.阳性克隆子。