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服务简介: 酵母双杂交由Fields在1989年提出。他的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。 GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域。 位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域(DNA binding domain,DNA-BD)和位于C端768-881位氨基酸残基区段的转录激活域(Activation domain,AD)。DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因(GAL4-responsivegene)的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS),并与之结合。 而AD则是通过与转录机构(transcriptionmachinery)中的其他成分之间的结合作用,以启动UAS下游的基因进行转录。 DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应,但是当二者在空间上充分接近时,则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子,使启动子下游基因得到转录。 Fields建立了一个双杂交系统,BD与X蛋白融合,AD与Y蛋白融合,如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物,使GAL4两个结构域重新构成,则会启动特异基因序列的转录. 他们利用Snf1与Snf4的相互作用,将Snf1与BD融合,Snf4与AD融合,构建在穿梭质粒上。其中Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶,Snf4是他的一个结合蛋白。研究者将二种穿梭质粒转化酵母GGY:171 菌株,该菌株含有LacZ报告基因,并已去除相应转录因子基因。 该实验的结果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空间上接近,激活了报告基因LacZ的转录。 一般地,将BD-X的融合蛋白称作诱饵(bait),X往往是已知蛋白,AD-Y称作猎物(prey),能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因,通过对报告基因的检测,反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用。 实验流程: 1.诱饵蛋白与猎物蛋白的生物信息学分析; 2.实验方案的制定; 3.诱饵蛋白表达载体构建; 4.表达载体转化酵母的验证及自激活活性,毒性检测; 5.文库转化或mating; 6.阳性克隆转接。 客户提供: 诱饵序列、模板及文库 交付内容: 1.原始数据、结果图片; 2.阳性克隆子; 上一篇酵母双杂膜系统文库筛选下一篇反向酵母单杂交文库筛选 |