|
服务简介: DUALmembrane 技术在传统的酵母双杂交系统的基础上,巧妙地利用分离的泛素系统(split-ubiquitin)进行蛋白质相互作用的筛选。 泛素(ubiquitin)分子量很小,由76aa残基组成; 高度保守的蛋白质;泛素作为降解信号分子,可以连接另外一种蛋白质的N端,然后被泛素专一性蛋白酶(UBPs)识别,从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。 分离的泛素系统(split-ubiquitin):泛素可以人为分成两部分:N端(Nub),C端(Cub)。 正常情况下,Nub和Cub仍具有很高的亲合力,表现出野生型泛素的功能,即仍发挥降解蛋白质的信号功能。 那么如何将泛素系统和酵母双杂交融合成一体呢?首先,人为地将泛素 Nub的3位异亮氨酸突变为甘氨酸(NubI突变为NubG)。这样与Cub的亲合力大大降低,避免了Cub和Nub自我结合或接近的可能性; 其次,将Cub部分与人工合成的LexA-VP16转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。因此正常条件下NubG 不与Cub结合,UBPs也不能识别分离的泛素,转录激活因子也不会被切下来。 最后,将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合,形成Bait融合蛋白(Bait-cub-LexA-VP16)和Prey融合蛋白(Prey-NubG)。如果Bait和Prey发生相互作用,就会促使NubG和Cub的相互接近,从而得到重构,被UBPs识别,导致LexA-VP16的解离,进入核内,从而激活报告基因的转录 。 DUALhunter系统就是在DUALmembrane系统的基础上,做了适当的修改,即通过一个小的膜蛋白(酵母ER蛋白Ost4)将胞浆蛋白(或核蛋白)固定到胞膜上,便于检测。 首先,将Bait蛋白(Bait-Cub-LexA-VP16)的N端和一个小膜锚蛋白(Ost4)融合在一起,形成融合蛋白(Ost4-Bait-Cub-LexA-VP16)(见图E);接着,将靶蛋白融合到泛素NubG部分的N端;如果Bait和Prey存在相互作用,促使泛素的NubG和Cub两个部分靠近,,从而分离的泛素得到重构,被UBPs识别,导致LexA-VP16的解离,进入核内,从而激活报告基因的转录。 实验流程: 1.诱饵蛋白与猎物蛋白的生物信息学分析; 2.实验方案的制定; 3.诱饵与猎物表达载体构建; 4.诱饵功能检测; 5.3-AT工作浓度检测; 6.共转化验证; 7.展示图制作。 客户提供: 诱饵及猎物的序列和模板。 交付内容: 1.原始数据、结果图片; 2.标准实验报告; 3.SCI标准Result Figure。 参考文献: 1,An Arabidopsis Dual-Localized Pentatricopeptide Repeat Protein Interacts with Nuclear Proteins Involved in Gene Expression Regulation 2,A Dominant Mutation in the HT1 Kinase Uncovers Roles of MAP Kinases and GHR1 in CO2-Induced Stomatal Closure 3,Arabidopsis ATG8-INTERACTING PROTEIN1 Is Involved in Autophagy-Dependent Vesicular Trafficking of Plastid Proteins to the Vacuole |